H O M E :: ศูนย์ข้อมูลโรคติดเชื้อและพาหะนำโรค
 Search :  
ความรู้ทั่วไปความรู้ทางวิชาการก้าวทันโลกระบาดวิทยาทางห้องปฏิบัติการงานวิจัยแหล่งข้อมูลที่เกี่ยวข้องFAQ
 
ความรู้ทั่วไปเกี่ยวกับโรคติดเชื้อและพาหะนำโรค
แลกเปลี่ยนประสบการณ์เกี่ยวกับโรคติดเชื้อ
 


   
ฮันตาไวรัส (Hantavirus)

ศิริมา ปัทมดิลก

1. บทนำ

        ฮันตาไวรัส ก่อให้เกิดโรคติดเชื้อในคนที่มีอาการรุนแรงและอัตราป่วยตายสูง โดยมีสัตว์ฟันแทะหลายชนิด(Rodents)เป็นพาหะ แต่ก่อนไม่มีใครทราบว่าฮันตาไวรัสเป็นสาเหตุของโรคไข้เลือดออกที่มีอาการทางไตร่วมด้วยและเป็นโรคติดต่อระหว่างสัตว์สู่คนที่พบมานานกว่าร้อยปีหรืออาจนับเป็นพันปีมาแล้วก็ได้เพราะจากบันทึกในประวัติศาสตร์ของจีนได้มีการบรรยายถึงเรื่องราวเกี่ยวกับโรคที่มีอาการคล้ายคลึงกับโรคไข้ เลือดออกที่มีอาการทางไตร่วมด้วย ทั้งที่ในขณะนั้นยังไม่มีใครทราบว่าอะไรเป็นสาเหตุ จนกระทั้งในสมัยสงครามเกาหลี (ระหว่าง พ.ศ. 2494-2499 ) เมื่อกองกำลังของสหประชาชาติที่ถูกส่งเข้าไปในเขตปลอดทหารบริเวณพรมแดนระหว่างเกาหลีเหนือและเกาหลีใต้ ป่วยเป็นโรคนี้หลายพันคน ในครั้งนั้นเรียกโรคนี้ว่า Korean Hemorrhagic Fever (KHF) จึงเริ่มเกิดความสนใจที่จะศึกษาอย่างจริงจังและหลังจากนั้นในปี พ.ศ. 2519 Dr. HO Wang Lee และคณะ สามารถแยกเชื้อไวรัสนี้ได้ครั้งแรกจากปอดของหนู (Apodemus agrarius) และในปี พ.ศ. 2521 สามารถแยกเชื้อจากผู้ป่วยได้ เชื้อไวรัสนี้ถูกตั้งชื่อว่า ฮันตันไวรัส (Hantaan virus) ตามชื่อของแม่น้ำที่กั้นพรมแดนระหว่างเกาหลีเหนือและเกาหลีใต้ ซึ่งเป็นบริเวณที่พบหนูพาหะชุกชุม จากผลการตรวจวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการและจากการศึกษาทางระบาดวิทยาพบว่า นอกจากฮันตันไวรัสแล้วยังมีไวรัสตัวอื่นที่มีคุณลักษณะคล้ายกัน (Hantaan related viruses) แพร่กระจายอยู่ทั่วทุกภูมิภาคโลก ก่อให้เกิดโรคที่อาการคล้ายกับ KHF จนกระทั่งในปี พ.ศ. 2525 องค์การอนามัยโลกได้ประชุมเพื่อหาข้อสรุป และให้เรียกชื่อ โรค KHF ที่มีสาเหตุจากฮันตันไวรัส หรือจากไวรัสตัวอื่นที่คล้ายกันนี้ว่า Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome (HFRS)

        ในปีพ.ศ.2528 ฮันตันไวรัส และไวรัสอื่นที่มีคุณลักษณะคล้ายกับ ฮันตันไวรัสนี้ถูกนำมาศึกษาด้านอนุกรมวิธานและจัดอยู่ใน Family Bunyaviridae, genus Hantavirus ซึ่งไวรัสในจีนัสนี้มักพบถูกเรียกโดยรวมว่า hantaviruses(ฮันตาไวรัส) ต่อมาในปีพ.ศ.2536 พบว่าเชื้อในกลุ่มฮันตาไวรัสนี้ สามารถก่อให้เกิดโรคที่มีอาการอย่างอื่นได้อีกคือโรคติดเชื้อในระบบทางเดินหายใจชนิดรุนแรง ซึ่งพบในสหรัฐอเมริกา และที่ถูกเรียกว่า Hantavirus pulmonary syndrome (HPS) และต่อมาพบรายงาน Hantavirus cardiopulmonary syndrome(HCPS)ในประเทศแถบอเมริกาใต้ด้วย ในปัจจุบันมีรายงานการพบเชึ้อฮันตาไวรัสสายพันธุ์ใหม่เพิ่มมากขึ้นในหลายพื้นที่ทั้งในทวีปเอเซีย ยุโรป และอเมริกา รวมทั้งมีพาหะและแหล่งโรค (reservoir host)ที่แตกต่างกันไปด้วย แต่ที่พบรายงานบ่อยว่าเป็นสาเหุตของโรคไข้เลือดออกที่มีอาการทางไตร่วมด้วย คือ Hantaan(HTN), Seoul(SEO), Puumala(PUU)และ Dobrava(DOB) สำหรับ Sin Nombre(SN) พบเป็นสาเหตุสำคัญของโรคติดเชื้อในระบบทางเดินหายใจชนิดรุนแรง นอกจากนั้นพบอีกหลายสายพันธุ์ที่ยังไม่ทราบว่าเป็นสาเหตุของโรคใด เนื่องจากฮันตาไวรัสเป็นสาเหตุของโรคติดเชื้อที่มีอาการรุนแรงและมีอัตราป่วยตายสูง ประกอบกับมีรายงานในแต่ละปีพบผู้ป่วยที่ต้องเข้ารักษาในโรงพยาบาลประมาณ60,000-150,000ราย ในจำนวนนี้พบเป็นผู้ป่วยที่อยู่ในทวีปเอเชียมากที่สุดถึงร้อยละ91.5 รองลงมาเป็นทวีปยุโรปร้อยละ8.5 ทวีปอเมริการ้อยละ0.04 และในทวีปแอฟริกาพบเพียงร้อยละ0.01 สำหรับประเทศในเอเชียที่มีรายงานพบมากที่สุดคือประเทศจีน รองลงมาเป็นรัสเซีย เกาหลี ญี่ปุ่นและประเทศในแถบเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ตามลำดับ

        การศึกษาฮันตาไวรัสในประเทศไทยพบมีรายงานการแยกเชื้อฮันตาไวรัสได้เป็นครั้งแรกเมึ่อปี
พ.ศ.2528 จากชิ้นเนื้อปอดของหนู2 สายพันธุ์(Rattus norvegicusและ Bandicota indica)โดย Dr. Elwell และคณะ จากสถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์การแพทย์ทหารฝ่ายอเมริกัน นอกจากนั้นยังพบรายงานการศึกษาเพื่อสำรวจความชุกของแอนติบอดีต่อเชื้อฮันตาไวรัสทั้งในคนและสัตว์ฟันแทะในหลายพื้นที่พบว่า คนไทยที่ไม่มีอาการป่วยด้วยโรคHFRS,HPSและHCPS มีแอนติบอดีต่อเชื้อฮันตาไวรัสอยู่ในช่วงระหว่าง1-33%และมีสัตว์ฟันแทะหลายชนิดเช่น Rattus rattus, Rattus exulans, Rattus norvegicus, Bandicota indica, Bandicota savilei พบมีแอนติบอดีต่อเชื้อฮันตาไวรัสอยู่ในช่วงระหว่าง2-24% ข้อมูลดังกล่าวชี้ให้เห็นว่ามีเชื้อฮันตาไวรัสแพร่กระจายอยู่ในประเทศไทย แต่เป็นที่น่าสังเกตว่ากลับไม่พบรายงานการแพร่ระบาดของโรคHFRS,HPSและHCPSเหมือนในประเทศอื่นๆที่กล่าวแล้วข้างต้น เป็นไปได้ว่าการติดเชื้อฮันตาไวรัสในประเทศไทยอาจแตกต่างจากอาการที่เคยพบหรือไวรัสที่แพร่กระจายอยู่เป็นสายพันธุ์ที่ไม่ก่อโรค อย่างไรก็ตามเพื่อลดความเสียหายที่อาจเกิดขึ้นหากมีการระบาดของโรค ดังนั้นการเตรียมความพร้อมทางห้องปฏิบัติการและการเก็บตัวอย่างผู้ป่วยที่สงสัยส่งตรวจจึงเป็นสิ่งจำเป็น

 

2. การตรวจวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการ

1.วิธีการตรวจวินิจฉัย
        การตรวจวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการสามารถทำได้หลายวิธี เช่น การแยกเชื้อจากผู้ป่วยหรือสัตว์ที่เป็นแหล่งโรค วิธีนี้ทำได้ค่อนข้างยาก ใช้เวลานาน และเนื่องจากฮันตาไวรัสเป็นเชื้ออันตรายที่สามารถติดต่อได้ทางการหายใจ จึงจำเป็นต้องทำในห้องปฏิบัติการที่มีมาตรการรักษาความปลอดภัยระดับ 3 (P3) วิธีที่นิยมใช้กันทั่วไปคือ การตรวจหาแอนติบอดีในซีรัม เทคนิคที่ใช้มีด้วยกันหลายวิธี เช่น enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), indirect immunofluorescent antibody (IFA), plaque reduction neutralization test (PRNT), hemagglutination inhibition test (HIT), immune adherence hemagglutination test (IAHT), high density particle agglutination (HDPA), และ Western blotting (WB) นอกจากนี้ยังมีวิธีอื่นๆ เช่น การศึกษารูปสัณฐาน (morphology) ของเชื้อโดยกล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอน การเพิ่มขยายยีน (PCR) และ ศึกษาการเรียงตัวของนิวคลีโอไทด์ (sequencing)

2.วิธีการตรวจวินิจฉัยมาตรฐาน
        แม้ว่าวิธีการตรวจวินิจฉัยมาตรฐานสำหรับการศึกษากลุ่มเชื้อฮันตาไวรัสที่ได้รับการแนะนำโดย WHO Collaborating Center for Virus Reference and Research (Hantaviruses), Asan Institute for Life Sciences, Seoul, Korea มีด้วยกันหลายวิธีเหมือนดังที่กล่าวแล้วในเบื้องต้น แต่วิธีที่จะขอแนะนำรายละเอียดของขั้นตอนในการทดสอบ สำหรับหนังสือคู่มือฉบับนี้คือ วิธี IFA ซึ่งเป็นวิธีที่ได้รับความนิยมสูง ให้ได้ผลการทดสอบที่น่าเชื่อถือ สามารถนำมาใช้ในการวินิจฉัยและศึกษาทางระบาดวิทยาได้


3.การเก็บและการนำส่งตัวอย่าง

        การตรวจหาระดับแอนติบอดีในน้ำเหลืองนั้น สามารถทำได้โดยการเจาะเลือดจากผู้ป่วยหรือจากสัตว์ที่เป็นแหล่งโรค เจาะเลือดประมาณ 2–3 มิลลิลิตร ทิ้งให้เลือดแข็งตัวที่อุณหภูมิห้อง ดูดน้ำเหลืองที่แยกตัวออกจากลิ่มเลือด หรือถ้ามีเครื่องปั่นให้ปั่นตะกอนเม็ดเลือดเก็บส่วนน้ำเหลืองนำไปใช้ทดสอบทันทีหรือเก็บไว้ที่ตู้เย็น4๐ซได้ไม่เกิน7วันหากนานกว่านั้นให้เก็บแช่แข็งไว้ที่-20° ซ เพื่อรอการทดสอบต่อไป ในกรณีที่ต้องส่งต่อตัวอย่างน้ำเหลืองไปเพื่อตรวจวินิจฉัยยังห้องปฏิบัติการอื่น ควรนำส่งด้วยตัวเอง แต่ถ้าไม่สามารถทำได้ควรเลือกบริการส่งที่ทำให้ตัวอย่างตรวจถึงห้องปฏิบัติการนั้นโดยเร็ว เช่น การส่งพัสดุทางเครื่องบินและที่สำคัญที่สุดคือตัวอย่างตรวจที่ถูกนำส่งจะต้องอยู่ในสภาพเย็นประมาณ4°ซ ตลอดเวลา


4. เครือข่ายการตรวจวินิจฉัย
        ในประเทศ
ห้องปฏิบัติการตรวจวินิจฉัยโรคติดเชื้อฮันตาไวรัสยังไม่พบที่เปิดบริการเป็นงานประจำ แต่มีหลายสถาบันที่ได้รายงานผลการศึกษาเกี่ยวกับฮันตาไวรัสในประเทศไทย อาทิเช่น สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์การแพทย์ทหารฝ่ายอเมริกัน, สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์สาธารณสุข กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์, คณะเวชศาสตร์เขตร้อน มหาวิทยาลัยมหิดล และภาควิชาจุลชีววิทยา คณะแพทยศาสตร์ ศิริราชพยาบาล มหาวิทยาลัยมหิดล

        ต่างประเทศ
        ห้องปฏิบัติการตรวจวินิจฉัยและศึกษาวิจัยโรคติดเชื้อฮันตาไวรัสมีอยู่หลายแห่ง เช่น WHO Collaborating Center for Virus Reference and Research (Hantaviruses), Asan Institute for Life Sciences, Seoul, Korea; Division of Viral and Rickettsial Diseases, Center for Diseases Control and Prevention , Atlanta, Georgia, USA; Institute for Animal Experimentation, Hokkaido University Graduate School of Medicine, Sapporo, Japanและอื่น ๆ

 

5. วิธีการตรวจวินิจฉัยโดยวิธีIFA

5.1 หลักการ
        แอนติบอดีในน้ำเหลืองที่มีความจำเพาะกับแอนติเจนของเชื้อฮันตาไวรัสจะจับกันเป็นสารเชิงซ้อน (antigen-antibody complex) แล้วตรวจสอบโดยใช้แอนติบอดีอีกชนิดที่ติดฉลากด้วยสารเรืองแสงและ มีความจำเพาะสามารถจับกับสารเชิงซ้อนนี้ได้ เมื่อดูด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงจะเห็นเซลล์ที่ติดเชื้อนี้เรืองแสงสีเขียวอมเหลือง

5.2 น้ำยา และอุปกรณ์
        1.สไลด์ที่มีเซลล์ที่ติดเชื้อฮันตาไวรัส
        2. สไลด์ที่มีเซลล์ที่ไม่ติดเชื้อ
        3. สารละลาย PBS
        4. Coplin Jar
        5. Cover glass
        6. กล่องพลาสติก
        7. Conjugate ที่จำเพาะกับชนิดของแอนติบอดีที่ต้องการตรวจสอบ (เช่น FITC conjugated antihuman IgG)
        8. น้ำกลั่น
        9. mounting media
        10. CO2 incubator
        11. กล้องฟลูออเรสเซนต์
        (หมายเหตุ : การเตรียมสไลด์ และสารละลาย ดูรายละเอียดในภาคผนวก)

5.3 วิธีทำ
        1. นำน้ำเหลืองที่ต้องการทดสอบมาเจือจางเป็นลำดับตั้งแต่ 1:32 – 1:4096 หรือมากกว่า แต่ละลำดับของความเจือจางเพิ่มเป็น 2 เท่า โดยเจือจางในสารละลาย PBS
        2. หยดน้ำเหลืองที่ถูกเจือจางแล้วนี้ ลงบนสเมียร์ของเซลล์ที่ติดเชื้อฮันตาไวรัสและเซลล์ปกติ
        3. สไลด์นี้ถูกวางลงในกล่องพลาสติกที่มีสำลีชุบน้ำบรรจุอยู่ นำเข้า CO2 incubator อุณหภูมิ 37°ซ นาน 1 ชั่วโมง
        4. นำสไลด์ใส่ใน Coplin Jar ที่มีสารละลาย PBS บรรจุอยู่ เพื่อล้างแอนติบอดี ที่ไม่จับกับแอนติเจนบนสไลด์ออก ล้าง 3 ครั้ง
        5. ทิ้งสไลด์ให้แห้ง แล้วเติม conjugate
        6. ทำเช่นเดียวกับข้อ 2 , 3 และ 4
        7. ล้างสไลด์ด้วยน้ำกลั่น 1 ครั้ง
        8. ทิ้งสไลด์ให้แห้ง แล้วหยด mounting media ปิดด้วย cover glass
        9. ดูด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง

5.4 การแปลผล
        1. ในรายที่ให้ผลบวก จะเห็นแอนติเจนของเชื้อฮันตาไวรัสบนผิวเซลล์ที่ติดเชื้อนี้ เรืองแสงสีเขียวอมเหลือง ในทางกลับกันเซลล์ปกติจะไม่เห็นการเรืองแสง
        2. ในรายที่ให้ผลลบ จะไม่เห็นการเรืองแสงทั้งเซลล์ที่ติดเชื้อ และไม่ติดเชื้อ
        3. ในรายที่ให้ผลบวก จะหาระดับความแรงของแอนติบอดีในน้ำเหลืองได้โดยอ่านลำดับความเจือจางสูงสุดที่เห็นการเรืองแสง


5.5 ระยะเวลาของการตรวจวินิจฉัย
        ใช้เวลาประมาณ 3 ชั่วโมง


5.6 ข้อควรระวัง
        ฮันตาไวรัสเป็นเชื้อก่อโรคอันตรายร้ายแรงจนอาจถึงแก่ชีวิต และพบว่ามีรายงานการติดเชื้อของบุคลากรในห้องปฏิบัติการที่ทำงานเกี่ยวข้องกับการแยกเชื้อค่อนข้างบ่อย ดังนั้นการทำงานที่เกี่ยวข้องกับการเพาะเลี้ยงไวรัสหรือการแยกเชื้อจากตัวอย่างส่งตรวจของผู้ป่วยหรือสัตว์ทดลองที่สงสัยว่าติดเชื้อไวรัสนี้ จึงต้องมีมาตรการระมัดระวังเป็นพิเศษ โดยต้องทำงานทดลองในห้องปฏิบัติการระดับ 3

6. เอกสารอ้างอิง

  1. .Lee HW, Calisher C, and Schmalijohn. Manual of hemorrhagic fever with renal syndrome and hantavirus pulmonary syndrome . WHO Collaborating Center for Virus Reference and Research (Hantaviruses), Asan Institute for Life Sciences, Seoul, Korea. 1998.
  2. พุธวัฒนา พิไลพันธ์. ไวรัสวิทยา.ฉบับพิมพ์ครั้งที่2.กรุงเพทฯ : อักษรสมัย.2540 21.14 - 21.18.
  3. Wasi C, Chaiprasithikul P, and Auewarakul P. Hantaviruses : Re-emerging disease.Bangkok, Thailand : Aksornsamai Press. 1995
  4. Sawasdikosol S, Tamura M, and Jamjit P. Antibody to haemorrhagic fever with renal syndrome in man and rat in Thailand. Bull Dept Med Sci 1989; 31:125-30.
  5. Elwell MR, Word GS, Tingpalapong M, and Le Duc JW. Serological evidenee of hantaan –like virus in rodents and man in Thailand. South-east Asian J Trop Med Pub Hlth 1985;16 :349-54.
  6. Khan AS, et al. Hantavirus pulmonary syndrome:The first 100 US cases . JID 1996;173 :1297-303.
  7. Nitatpattana N, Chauvancy G, Dardaine J, Poblap T, Jumronsawat K, Tangkanakul W, Poonsuksombat D, Yoksan S, and Gonzalez JP. Serological study of hantavirus in the rodent population of Nakhon Pathom and Nakorn Ratchasima province Thailand. South-east Asian J Trop Med Pub Hlth 2000; 31 : 277-82
  8. Araki K, Yoshimatsu K, Ogino M, Ebihara H, Lundkvist A, Kariwa H, Takashima I, and Arikawa J. Truncated hantavirus nucleocapsid proteins for serotyping Hantaan, Seoul, and Dobrava hantavirus infections.J. Clin. Microbiol. 2001; 39 : 2397-2404.

7. ภาคผนวก
        7.1 การเตรียมสไลด์ที่มีเซลล์ติดเชื้อฮันตาไวรัส และไม่ติดเชื้อ
                7.1.1 เพาะเลี้ยงเชื้อฮันตาไวรัสสายพันธุ์ที่ต้องพบการทดสอบในเซลล์ Vero-E6
                7.1.2 ย่อยเซลล์ที่ติดเชื้อไวรัสด้วย Trypsin
                7.1.3 เติม Eagle’s minimal essential medium ที่มี 5% heat inactivated fetal calf serum ผสมอยู่ ใช้ปิเปตดูดเป่าเบาๆให้เซลล์หลุดลอยเป็นเซลล์เดี่ยว ๆ
                7.1.4 ปั่นตะกอนเซลล์โดยใช้ความเร็วรอบ 1,200 รอบต่อนาที นาน 3 นาที
                7.1.5 ทิ้งส่วนน้ำใส
                7.1.6 ผสมตะกอนเซลล์ให้เข้ากันดีแล้วสเมียร์ slide ทิ้งไว้ให้แห้ง
                7.1.7 แช่สไลด์ใน acetone นาน 10 นาที ทิ้งให้แห้งนำไปใช้ทดสอบได้ทันที หรือเก็บไว้ที่ -70๐
                7.1.8 การเตรียมสไลด์ของเซลล์ที่ไม่ติดเชื้อทำเช่นเดียวกันตั้งแต่ข้อ 7.1.2-7.1.7

        7.2 การเตรียมสารละลาย PBS (pH7.2-7.4)

NACl
8
กรัม
KCl
0.2
กรัม
Na2HPO4  12H2O
2.9
กรัม
(Na2HPO4 anhydrous
1.15
กรัม)
KH2(PO4)2
0.2
กรัม
น้ำกลั่น
1000
กรัม


        7.3 ภาพแสดงเซลล์ติดเชื้อฮันตาไวรัสทำปฏิกิริยากับน้ำเหลืองที่ทดสอบให้ผลเป็นบวก


ที่มา : หนังสือ โรคติดเชื้ออุบัติใหม่และอุบัตซ้ำ : คู่มือการตรวจวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการ
สถาบันวิจัยวิทยาศาสตร์ศาสตร์สาธารณสุข กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์